В 1921 окончил московскую театральную студию «Молодые мастера» (ученик И. Н. Певцова), до 1927 играл в театрах провинции и Москвы, затем Ленинграда, часто меняя сцены. В 1931-35 работал в Академическом театре драмы (бывший Александринский), в 1937-40 — актер, режиссер и художественный руководитель БДТ им. Горького, в 1940-47 — в московском Театре им. Евг. Вахтангова, в 1948-51 и с 1955 — в Малом театре (также и режиссер), в 1952-53 — главный режиссер московского театра им. Пушкина. Наиболее важные театральные роли: Влас в «Дачниках» М. Горького (1939), Клаверов в «Тенях» М. Е. Салтыкова-Щедрина (1953), Иванов («Иванов» А. П. Чехова, 1960; был также режиссером спектакля).
Среди театральных постановок: «Нора» Т. Ибсена (1935, дебют), «Царь Потап» А. А. Копкова (1940), «Бранденбургские ворота» М. А. Светлова (1947, Театр-студия киноактера в Москве), «Дачники» (1964) и «Фальшивая монета» (1972) Горького, «Гроза» А. Н. Островского (1974).
Начиная с 1927, снялся более чем в 25 фильмах; среди ролей — большевик Андрей («Подруги», 1935), поручик Молдавский («Оборона Царицына», 1942), генерал Огнев («Фронт», 1943), председатель колхоза Выборнов («Родные поля», 1945, его же постановка), Сэм Боулдер («Бегство мистера Мак-Кинли», 1975; Государственная премия СССР, 1977, посмертно). Но поистине творческой вершиной и взлетом всенародной славы артиста стала роль Василия Ивановича Чапаева в фильме братьев Васильевых «Чапаев» (1934; Сталинская премия, 1941). Экранный образ знаменитого красного командира Гражданской войны вытеснил реального исторического Чапаева благодаря исключительной яркости и блеску актерского исполнения. Чапаев у Бабочкина — и уникальная индивидуальность, и тип человека революционной эпохи и русского национального характер; он одновременно и талантливый военачальник, и атаман ватаги, мудрец и невежда, сильный и беззащитный, и вместе с тем — деспот, фанфарон, поражающий причудливым сплавом различных качеств. Живость и обаяние образа, воплощенного Бабочкиным, сделало Чапаева истинно народным героем, персонажем поистине фольклорным, героем притч и анекдотов.
Из поздних актерских работ Бабочкина выделялись телевизионные экранизации «Скучной истории» по Чехову (Николай Степанович, 1968), «Плотницких рассказов» по В. И. Белову (Алеша Смолин, 1972). С 1944 преподавал во ВГИКе.