Марчелло родился в поселке Фонтана-Лири в семье столяра и домохозяйки. В юности Марчелло работал кем только можно, даже слесарничал, вечерами он играл в любительской труппе в Универсальном театре в Риме. Туда он пришел в 1947 году. Как-то раз его увидел известный режиссер Лукино Висконти. Он тут же пригласил Марчелло в свою труппу. Надо сказать Лукино не прогадал. Он сразу сообразил, что Марчелло незаурядное дарование. Очень скоро под руководством Висконти Марчелло стал профессиональным актером. Он чудесно сыграл в сложной пьесе «Трамвай «Желание»».
В 1950 году Марчелло блестяще дебютировал в фильме «Августовское воскресение». С тех самых пор Марчелло не расставался с миром кино. Марчелло был удивительно работоспособным и трудолюбивым. Он мог сниматься в трех или четырех картинах в год. Его героями чаще всего были веселые и простодушные люди. У них было доброе сердце и легкий нрав. Одновременно они были и смешными и лиричными. Однако были и другие роли – серьезные, глубокие, драматичные. У Висконти Марчелло играл мечтателя Марио из фильма «Белые ночи». Это модернизированный роман Достоевского. Через два года он играет журналиста Марчелло в фильме Фредерико Феллини «Сладкая жизнь». Именно эта роль принесла Мастроянни мировую славу. На фестивале в Каннах в 1960 году эта картина получила первое место. В Италии Марчелло Мастроянни признали лучшим актером года. С этого момента его имя и фото не сходили со страниц киножурналов. Продюсеры и режиссеры засыпали его предложениями. Марчелло почти всегда соглашается. Ему интересно играть все, ведь он сильно любит кино.
Любимое занятие Марчелло – посмеяться над самим собой. Кстати, Марчелло был неисправимым чревоугодником. Он никогда этого не скрывал. Об этом грехе актера говорили многие, кто хорошо его знал. Перед съемками трагичных или эпичных сцен Марчелло ел очень много и с удовольствием. Режиссеры недоумевали, а Марчелло отшучивался.
В комедии «Развод по-итальянски» Мастроянни сыграл «итальянского Обломова», барона Фефе Чефалу. Далее была очень сложная роль в экранизации романа Пратолини «Семейная хроника». Этот образ в творчестве актера назвали одним из лучших. Эта лента разделила Большую премию международного кинофестиваля.
Свою будущую жену Марчелло увидел еще студенткой в Академии драматического искусства. Они познакомились, а в 1950 году обвенчались. Его женой стала Флора, которая была дочерью одного известного музыканта. Потом Марчелло неоднократно увлекался женщинами, но не разводился. Флора сильно плакала и злилась после первой измены мужа. Однако потом она стала спокойнее переживать измены мужа. Она занималась домом и дочерью Барбарой. Она всегда ждала его.
Однако настоящая и пылкая любовь, как говорил сам Марчелло, была между ним и Катрин Денев. Марчелло встретился с ней, когда ему было 48 лет, а ей 29. У них родилась дочь Кьяра. Она очень похожа на отца внешне и тоже актриса, носит его фамилию.
Творческий союз Марчелло – Софи Лорен стал в истории мирового кино самым известным и уникальным явлением. Они создали самую знаменитую актерскую пару, которая сыграла в двенадцати фильмах и получив огромное количество престижным наград.
Он знал о своей болезни – рак поджелудочной железы. Однако продолжал работать. В конце 1996 года Марчелло играл роль в комедийной пьесе «Последние луны». Роль у него была старого профессора, который сказал: «Я хочу умереть под Рождество, чтобы вокруг лежал снег…». Именно эти слова стали пророческими для Марчелло. 19 декабря 1996 года в туманный и холодный день под Рождество актер скончался у себя дома в Париже. Рядом с ним были Кьяра и Катрин.