Гийом родился в деревеньке близ Лиможа. Его отец был адвокатом. В 12 лет Гийом начал обучение в одной из школ Парижа, случилось это благодаря одному офицеру, который был другом семьи. Гийом хотел пойти в армию после учебы, но отец настоял на том, чтобы сын его пошел в медико-хирургическую школу в Лиможе. Гийом, недолго проучившись в этой школе, в возрасте 16 лет вернулся в Париж, где продолжил обучение в университете. В Эколь де Санте Дюпюитрен посещал лекции по анатомии, поэтому был в курсе вскрытий в медицине. В 1797 году он закончил обучение в университете, к тому времени Гийом обратил на себя внимание медицинской общественности.
На основе результатов вскрытия умерших Гийом к 1801 году написал монографию по патологической анатомии. Он читал курс патологии с Бейлем и Лаэннеком, которые были его помощниками. С последним у Дюпюитрена сложились плохие отношения. В 1803 году Гийом получил докторскую степень. В старейшей больнице Парижа, носившей название Отель-Дьё, его назначили вторым хирургом, к 1808 году он стал заместителем главного хирурга.
Дюпюитрен одним из первых разработал методику вправления застарелых вывихов. Он описал абсцесс Дюпюитрена, перелом, переломовывих Дюпюитрена, контрактуру Дюпюитрена. Он же описал так называемый симптом пергаментного хруста. Гийом создал и несколько хирургических инструментов: эластичный зажим для кишки, а также инструмент для раздавливания шпоры при закрытии наружного кишечного свища.
В 1815 году он стал руководителем клиники Отель-Дьё. Больница стала одной из лучших во всей Европе в те времена. В 1832 году Гийом издал «Лекции по клинической хирургии» в четырех томах. Спустя год врач перенес инсульт, он стал инвалидом, а потому уволился из клиники в 1834 году, после более чем 30 лет службы в ней. Он посетил Италию. После поездки Гийом даже возобновил свою врачебную практику, но проблемы со здоровьем давали о себе знать. От скопления гноя в грудной клетке великий хирург умер в 1835 году. Его похоронили на кладбище Пер-Лашез.
За медицинские и научные заслуги врача награждал король Франции. Карла X Дюпюитрен оперировал лично, когда у монарха была катаракта. В историю Дюпюитрен еще вошел богатейшим врачом всех времен, заработав на приемах больных миллионы франков.