О молодости путешественника известно немного, за исключением того факта, что он родился 4 мая 1827 года в Бакленд Брюэр, недалеко от Бидефорда, Северный Девон.
Джон поступил на службу в британскую армию в 1844 году и отправился в Индию. Там он служил в Пенджабе под руководством сэра Колина Кэмпбелла. Спик был предприимчивым молодым человеком, который исследовал Гималайские горы, а также побывал в Тибете. В 1854 году будущий путешественник получил отпуск и совершил свою первую поездку в Африку. Он хотел пересечь Аденский залив и собрать образцы в Сомалиленде для музея естествознания своей семьи в Сомерсете. Однако ему было отказано в разрешении на это путешествие, поскольку Сомалиленд считался довольно опасным местом. Спик присоединился к Ричарду Бертону, известному исследователю, чтобы отправиться в Сомали. Их группа столкнулась с жестоким нападением местных жителей в апреле 1855 года, в результате чего Джон был тяжело ранен, но, в конце концов, ему удалось бежать. Вернувшись к своим обязанностям, он служил капитаном в турецком полку в Керчи во время Крымской войны (1855–1856). В конце 1856 года Бертон пригласил Спика присоединиться к нему в экспедицию по поиску истоков реки Нил. Они отправились в восточную Африку, чтобы найти столь востребованный источник Нила, начали с острова Занзибар в июне 1857 года и в течение шести месяцев исследовали восточноафриканское побережье, пытаясь отыскать лучший маршрут внутри страны. Их команда достигла озера Танганьика в феврале 1858 года. Путешественники также слышали о другом озере на северо-востоке, но решили исследовать его на обратном пути к побережью. Тем не менее, Бертон сильно заболел во время обратной поездки, и Спик решил оставить его в базовом лагере и продолжить путь в одиночку. Джон Хеннинг Спик путешествовал в течение 47 дней, за которые преодолел 452 мили, а 30 июля 1858 года нашел большое озеро, которое назвал в честь королевы Виктории. Именно этот человек стал первым европейцем, достигшим озера Виктория в Восточной Африке. Он же определил озеро как источник реки Нил. Это открытие, хотя и подвергавшееся большим сомнениям при жизни ученого, оказалось верным спустя годы после его смерти.
В Африке Джон влюбился в 18-летнюю девочку по имени Мери. Однако его любовь была односторонней, сердце исследователя было разбито из-за его неспособности, получить благосклонность девушки. 15 сентября 1864 года Джон Хеннинг Спик отправился на дневную охоту в парк Нестон в Уилтшире. Там он умер от выстрела. Остается неясным,
был ли это несчастный случай или самоубийство. Путешественника похоронили в Сомерсете, прародине семьи Спиков.