Будущая королева появилась на свет 24 октября 1503 года в столице Португалии. Ее родителями были король Мануэл I и Мария Арагонская. Девочка стала вторым ребенком и старшей дочерью короля. Изабелла являлась внучкой католических монархов, получила имя в честь бабушки (материнская линия) и тети, принцессы Астурийской, которая до этого являлась женой Мануэла. У нее было счастливое детство в богатой семье. Свою молодую жизнь она провела во дворце Рибейра, который позже был разрушен землетрясением. Будущая императрица любила изучать новые языки, обожала литературу. У нее была обширная библиотека. Она выучила латынь, испанский и французский, прежде чем стала достаточно взрослой, чтобы выйти замуж.
Служила регентом с 1529 по 1532 год, с 1535 по 1536 год и с 1538 по 1539 год. Это была способная женщина, твердо решившая вершить дела королевства с легкостью и изяществом.
Изабелла была красивой и умной. Она явно была рождена для королевской власти, а не просто для роли жены и матери. Когда Карла не было, супруга писала ему письма, делясь новостями об их королевстве и спрашивая о его благополучии. Император часто отвечал, но когда он не мог писать больше нескольких дней, Изабелла всегда проверяла его. Она даже однажды отругала его за то, что не знала о его местонахождении, и сказала, что будет писать ему каждые 20 дней. По возвращении императора Карла в его королевство Изабелла устроила ему грандиозный прием.
Королева вела очень простую жизнь. Она была очень любящей женой, а также преданной матерью. У нее было шестеро детей, из которых выжили только трое. Однако женщина с большой заботой воспитывала оставшихся детей и думала об их образовании. У Изабеллы было семь беременностей и два выкидыша. Говорят, что боль от потери детей опустошила ее. Седьмая беременность оказалась роковой. 21 апреля 1539 года императрица произвела на свет мертвого мальчика. Совсем скоро после родов Изабелла Португальская скончалась от лихорадки и кровотечения. Это произошло 1 мая 1539 года в возрасте 35 лет. Ее смерть сильно повлияла на императора Карла. Он отказался вступить в повторный брак и оставался холостым до конца своих дней, не снимал черное, оплакивая смерть жены. Женщина была похоронена со своим сыном Филиппом в Королевской часовне Гранады, а Карл заперся в монастыре на два долгих месяца, чтобы оплакивать ее и пережить потерю. Отдавая почтение своей жене, Карл выражал это благодаря искусству и музыке. В 1540 году нанял композитора Томаса Креквийона, чтобы тот написал новую музыку в честь покойной жены. В 1543 году им был нанят художник по имени Тициан, чтобы тот нарисовал Изабеллу. Живописец создал несколько портретов, в том числе «Портрет императрицы Изабеллы Португальской» и «Глория». Карл представил своему королевству цветок (красную гвоздику), который стал знаком любви к жене. Со временем он стал цветочной эмблемой Испании. В 1574 году Карл был похоронен бок о бок возле жены, согласно его последнему желанию. В 1654 году их правнук Филипп IV дал приказ об их перезахоронении в пантеоне королей. Многие сочли это признаком неуважения к королевской чете.